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Dünnschichtchromatographie

Fingerspitzengefühl gefragt

Keine Frage, die Dünnschichtchromatographie, kurz DC genannt, zählt zu den aussagekräftigsten Prüfungen in der Apotheke. Mit wenig Zeit- sowie Materialaufwand sind pflanzliche Ausgangsstoffe, fette oder ätherische Öle, aber auch Wirkstoffe identifizierbar. 
Ingrid Ewering
25.07.2019
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Ein Stoffgemisch teilt sich je nach Affinität zur stationären Phase und mobilen Phase mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie auf. Aufgrund des geringen Materialverbrauchs und der zügigen Entwicklung bei hoher Aussagekraft haben sich kleine Kieselgelplatten mit Fluoreszenzindikator F254 bewährt.

Es kann traditionell vertikal mit einer kleinen Chromatographiekammer (DAC Probe 11) gearbeitet werden. Ein rundes Glasgefäß, idealerweise mit flachem Boden und mit einer passenden Petrischale als Deckel, reicht aber völlig aus. Die Platte, die nur mit der nicht beschichteten Seite an der Wand anliegen darf, läuft unter Verbrauch von bis zu 10 ml Fließmittel zwischen 5 bis 10 Minuten.

Noch schneller und unter Verbrauch von nur 1 bis 2 ml Fließmittel arbeitet die Horizontalkammer. Denn das Fließmittel muss sich nicht entgegen der Schwerkraft über Kapillarkräfte hocharbeiten. Dazu ist jedoch die Anschaffung einer etwas kostspieligen Kammer wie zum Beispiel die CAMG-Kammer sowie die H-Kammer DEGASA zwingend notwendig (DAC Probe 10).

In beiden Fällen wird über die Glassinterplatte, kurz Fritte genannt, das Fließmittel zur Kieselgelschicht zugeführt. Die DC-Glasplatte muss also mit der Schicht nach unten so eingelegt werden, dass die Startlinie oberhalb der Fritte liegt

Nun kann das aufgesaugte Fließmittel die Trennung vornehmen. Es hat sich bewährt, Reste des Fließmittels unter dem Abzug abdampfen zu lassen. Achtung, die Fritte ist sehr zerbrechlich und muss mit Fingerspitzengefühl eingesetzt und vor allem nach Gebrauch sorgfältig mit Ethanol gereinigt werden. Die im Viererset gelieferten Glasplatten müssen vor der Beschriftung beherzt über eine Tischkante erst halbiert, dann geviertelt werden. Ganz wichtig ist dabei, die Sorptionsschicht nicht zu beschädigen.

Angaben/Methode DAC Probe 11: vertikale Dünnschichtchromatographie auf kleinen Platten DAC Probe 10: horizontale Dünnschichtchromatographie auf kleinen HPTLC-Platten
Stationäre Phase meist DC-Alufolien (Fertigplatten) HPTLC-Glasfertigplatten* (Fertigplatten)
Art und Größe 5 x 7,5 cm (< 10 x 10 cm) 5 x 5 cm
Schichtdicke 0,2 – 0,25 mm 0,1 – 0,2 mm
Mittlere Korngröße 10 – 12 µm 2 – 10 µm, (Ø 6 µm + sehr einheitliche Korngrößenverteilung)
DC-Kammer normale Kammer horizontale Kammer
Fließmittel circa 10 ml circa 1-2 ml
Laufstrecke circa 6 cm circa 4 cm
Menge an Referenz- und Untersuchungslösung circa 1 bis 20 µl circa 0,1 bis 0,5 µl
Entwicklung vertikal horizontal
Laufzeit 5 bis 10 Minuten 1 bis 5 Minuten
Anwendung qualitativ, halbquantitativ qualitativ, halbquantitativ
Die Tabelle vergleicht die DC mit Míkro- und HTPLC-Platten. *Fertigplatten zur Hochleistungsdünnschichtchromatographie

Beschriften, betupfen und entwickeln

Vor Gebrauch muss die DC-Platte mit einem weichen Bleistift (Härte 2B) gekennzeichnet werden. Das Ende der Laufstrecke wird eingezeichnet. Nach Möglichkeit sollte das Fließmittel diese Stoplinie nicht überschreiten. Falls dies doch eintritt, so ist die tatsächliche Laufstrecke einzuzeichnen. Abkürzungen am oberen Rand der Platte wie UL (Untersuchungslösung) sowie PL (Prüflösung), eventuell mit Nummerierung, haben sich bewährt. Auf der Startlinie können bis zu sechs Startpunkte als Kreuz gekennzeichnet werden. So lassen sich in einem Arbeitsgang zum Beispiel bis zu sechs Glucocorticoide identifizieren.

In der Mitte des Kreuzes wird die Untersuchungslösung mit Hilfe einer Mikrokapillare je nach Vorschrift mit einem Fassungsvermögen von 1, 2 oder 5 µl so lange aufgetupft, bis unter der UV-Lampe eine deutliche Fluoreszenzlöschung auftritt. Der Fleck nach Abdunsten des Lösungsmittels sollte nicht größer sein als 2 mm. Bei bandenförmiger Auftragung (Drogen und andere Vielstoffgemische) sind schmale Zonen von 2 mm Breite bis zu 10 mm Länge anzustreben. Die Untersuchungs- sowie Vergleichssubstanzen müssen immer komplett gelöst vorliegen.

Dazu wird die vorgeschriebene Menge in ein kurzes Reagenzglas eingewogen und das vorgeschriebene Lösungsmittel ergänzt. Da dieses recht schnell verdampft, ist zügiges Arbeiten ratsam. Praktisch veranlagte Apothekenmitarbeiter lösen aus Zeitgründen eine Spatelspitze Untersuchungssubstanz direkt auf eine Tüpfelplatte. Es kann jedoch zu einer sogenannten »Schwanzbildung« kommen, denn die Konzentration der zu untersuchende Substanz ist zum Teil einfach zu hoch.

Das frisch hergestellte sowie homogene Fließmittelgemisch wird in die DC-Kammer gegeben. Bei der Horizontalkammer erfolgt dies mit Hilfe einer Pipette. Beide Gefäße sind zügig mit der Petrischale beziehungsweise dem Glasdeckel zu verschließen, sodass keine Entmischung aufgrund der unterschiedlichen Dampfdrücke erfolgt. Ist keine Kammersättigung vorgeschrieben, so braucht weder die Kammer mit Filterpapier ausgekleidet noch die Wartezeit von bis zu 15 Minuten beachtet zu werden. Nach der Entwicklung wird die Platte mit einer Tiegelzange unter dem laufenden Abzug von Resten des Laufmittels befreit.

Auswerten, besprühen, dokumentieren

Die trockene, kaum noch nach Fließmittel riechende Platte ist zunächst bei Tageslicht zu betrachten und anschließend unter der UV-Lampe auszuwerten. Dabei wird eine Fluoreszenzminderung im UV-Licht bei 254 nm Wellenlänge mit einem durchgehenden Bleistiftkreis dokumentiert. Fluoresziert die Substanz im UV-Licht bei 365 nm Wellenlänge, so wird eine strahlende Sonne gezeichnet. Bitte eine UV-Schutzbrille tragen! Zügig ist der Rf-Wert (Retentionsfaktor) über folgende Formel errechnet:

Rf -Wert = Entfernung der Substanz vom Start / Entfernung der Fließmittelfront vom Start

Dann wird der Rf-Wert mit den Literaturdaten verglichen.

Anschließend erfolgt nach Vorschrift das Besprühen der Platte unter dem laufenden Abzug. Ein alter Schuhkarton dient als preiswerte Sprühkammer. Bessere Ergebnisse werden zum Teil durch Tauchen der Platte in eine mit Nachweisreagenz befüllte Petrischale erzielt. Auch fällt die Inhalationsgefahr des Aerosols weg.

Modedroge Cannabisblüten

Getrocknete Pflanzenteile einschließlich der momentanen Modedroge Cannabisblüten sind sehr gut über eine Dünnschichtchromatographie identifizierbar. Aber als alleinige Prüfmethode ist die Chromatografie nicht erlaubt. Zunächst wird in der »Alternativen Identifizierung Cannabisblüten« das Aussehen der Ganzdroge beschrieben und fordert den Abgleich mit einer Vergleichsdroge nachgewiesener Identität. Das makroskopische Aussehen der Blütenstände ist ausführlich im Text beschrieben. Da das NRF aussagekräftige Fotos von der Ganzdroge zur Verfügung stellt, kann auf die Vergleichsdroge sicherlich verzichtet werden.

Als zweite Prüfung fordert die Vorschrift eine Dünnschichtchromatographie, die wahlweise vertikal oder horizontal durchzuführen ist. Als Referenz ist eine aufbereitete Droge mit abweichender Chargenbezeichnung vorgeschrieben. Doch welche Apotheke besitzt diese? Deshalb erlaubt die Vorschrift als zweite Referenz zwei in jeder Apotheke oft vorrätige Chemikalien als sogenannte Laufweitenmarker: Bornylacetat R sowie Menthol R. Im oberen Drittel auf Höhe des Bornylacetats sind die beiden Hauptinhaltsstoffe THC sowie CBD der Cannabisblüten zu finden, wobei THC etwas höher läuft.

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